tenim 5 estrategies de silenciament de la funció gènica, quines??	1. oligonucleotods antisentit 2. RNA interferència 3. short hairpin RNAs o shRNAs 4. edició del genoma: zinc finger nucleases, tales transcription activator-like efectors o CRISPR/Cas9 5. estrategua Exon skipping
silenciamemt amb oligonucleotids antisentit. quantes bases el formen? direcció seq? pq silencia??	són polimers sintetics formats x desoxint o ribont modificats amb una longitud de 15-20bases. seq 3'-5', complementaria a una dr les cadenes de mRNA. es silencia pq forma una estructura de doble cadena i o no es tradueix o les endonucleases el degraden i x tant hi haurà menys producció de proteïna.
quin és el mecabksme da ció deks oligo antis x silenciar? poden jnir-se a exons i introns	EXONS: Doble cadena oligontas impedeix traducció i fa q endonucleases degradin el mRNA INTRONS: no es farà l'splicing.
2. RNA interferencia. a quin nivell impedeix l'expressió gènica	- traducció - transcripció (la dificulta(
RNAint. com funciona??	quan un virus/bact infecta una cell com a defensa es sintetitza dsRNA (RNA de doble cadena) i amb la proteina DICER es trenquen a siRNA (RNA +petits i de cadena simple). si els siRNAs són complementaris a una det. seq de mRNAs, es forma un complex DICER, siRNA i proteina RISC q impedeix la traducció del gen
disseny d'un siRNA 1. longitud 2. 4 regions a evitar 3. repeticions si o no? 4. analisis q cal fer. 5. disseny controls +o-?	1. longitud: 21nt. 2. 4 regions a evitar: compreses entre el 50-100bp del codo inici i de l'stop, reg introniques, amb molt o poc GC (30-60% b), repeticions de 4 o + bases. 3. repeticions si o no? 4. analisis q cal fer. blast. 5. disseny controls +o-? -
com podem comprovar l'efectivitat dels siRNAs?	1. quantificar l'RNAm: fent una RT-PCR (a punt final no valdria) 2. quantificar la proteïna:fent un western-blot amb un anticos 1a dirigit a la proteina o un anticos 2a dirigit a l'Ac 1a i marcat
3. tec shRNAs o short hairpin RNAs. quin és el seu mecanisme? quin avantatge tenen respecte els siRNAs?	mateix mecabisme que els siRNAs però s'introdueixen a les cells en un vector i aixi la seva expressió pot ser transitoria, induïble o permanent. elnplasmidi té una seq de DNA q transcriu shrna (cadena simole xo q té 2 seq complementaries sobre elles mateixes i formaran un loop, en el q hi ha dianes de restricció q acabaran formant els siRNAs.
pegues i inconvenients dels siRNAs	activació de la resposta immune i inhibició transitoria
les 3 estrategies d'edició del genoma x una resposta permanent són..? en què es basen??	1. zinc finger nucleases 2. tales transcription activator-like efectors 3. CRISPR/Cas9 es basen l'ús d'endonucleases q tallen la doble cadena de DNA, els dits de ZN i Tales són proteines q detecten de manera molt especofica una seq de nt i serveixen x crear knock-out i knock-in
Zn Finger: quants factors de transcripció hi ha?? a quin domini catalitic s'uneix??	3 factors q s'uneixen al domini catalitic de ma proteina Fok I q és una endonucleasa
Zn Finger: quina estructura tenen?? què detecten?? qui fa el tall a quants nt?? com funciona FokI	estructura ZnF: 31aa rics en cisteines i histidines que detecten de manera molt fidel 3 nt. el tall el fan 3 dits de Zn com a minkm que determinaran una seq de 9nt és a dir els dits de Zn reconeixen una seq de 9nt i FokI fa el tall. fokI funciona com a dimer, calen 2 x fer el tall, cadascuna s'uneix a una cadena
TALES: Origen?? format x?? qui fa el tall??	prove del patogen de les pantes Xanthomonas sp. són proteines d'unió al DNA especifiques de lloc amb un domini d'unió molt conservat format de 33-35aa el peptid TALE es fusiona al domini catalitic FokI que tallarà la cadena de DNA, igual q en ZNFinger cal un dimer per fer el tall.
Cert o fals: els dominis catalutics de la prpteïna FokI aniran units als mateixos pèptids FokI	fals, pq FokI té els pèptids Tale a esquerra i dreta units a diferebts punts de la mateixa cadeina
mecanisme d'acvió de tale i znf x knock-out i -in	-out: la cell detecta q hem tallat i intenta reparar introduint nt a l'atzar, lo + probable és q es perdi el marc de lectura-> silenci. -in: afegeix un fragment de DNA de doble cadena q tingui els 2 extrems seq de RecomHomo.
cicles q pateix la cell quan és infevtada x un virus	1- CICLE LITIC: es recircula el DNA del virus fent plasmidis i creant copies del material generic del.virus i les seves proteines trencant la cell hoste 2-CICLE LISOGÈNIC: DNA s'incorpora al cromosoma de la cell hoste i llavors forma els CRISPR arrays. es poden sintetitzar proteines i crear virions xo el material es queda permanentment. la cadena de RNA es fragmentarà en trossos petits i s'unirà al material genetic dl virus si hi ha una nova infecció i s'activaran les proteines Cas9 x evitar la nova infecció.
que necessitem pl sistema CRISPSR	1- gen que volem editar 2- cadena de RNA guia complementaria a la seq del gen on volem fer el tall. A la q afegirem el fragment SCAFFOLD q s'unirà especificament a la proteina Cas9 (endonucleasa)
que necessita la proteina Cas9??	la proteina Cas9 necessita la seq PAM (seq diana per fer el tall) -seq PAM cadena codificant: 1nt+2G -seq PAM cadena comple. 1nt+2C
mecanisme CRISPSR	el domini Scaffold q està unit a la cadena guia atraurà a la proteina Cas9 q detectarà la diana PAM i tallarà la doble cadena.
a antatge CRISPR en front Tales i ZnF	crispr actua x moltes especies, els altrea dos x poques.
estrategia exon skipping malaltia?? exo afectat? estrategia? problema de lestrategia?	la malaltia distrofia muscular de Duchenne està lligada al cromosoma X, el gen de la proteina distrofina té una mutació a l'exó51 q provoca la terminació prematura de la proteï a, no afecta ni a l'estructura ni a la funció. x evitar l'ecpressió de l'exó51 usem oligont antisentit però no és permanent.

Descubre

Crear Tarjetas

Acerca de Nosotros

Explore Tarjetas

Comparta este Set de Tarjetas de Aprendizaje

Tarjetas de Aprendizaje relacionadas

T3 Tecniques I Estrategies De Silenciament

Cómo estudiar sus tarjetas

Rango de Cartas a estudiar

21 Cartas en este set