¿EN QUÉ CONSISTE TERAPIA GÉNICA?	En principio la Terapia génica se define como la sustitución o reparación de un gen defectuoso en todas las células del organismo, es decir “curar un gen”. Podrá ser terapia génica somática o bien germinal.
A favor de la TG	o Es obligación moral de los profesionales de la salud utilizar los mejores métodos de tratamiento asequibles o Los padres tienen el derecho y la obligación de tener acceso a las tecnologías que les permitan conseguir hijos saludables o La modificación génica de la línea germinal puede ser más eficaz y menos costosa económicamente que la terapia génica somática o La ética que rige la ciencia y la medicina considera que el conocimiento posee un valor intrínseco
Argumentos en contra TG	o Intervención económicamente costosa y aplicable a un número limitado de pacientes o Accesibilidad de métodos alternativos para la prevención de las enfermedades genéticas o Riesgos inevitables, errores irreversibles. Uno de los principales problemas es que si intentamos arreglar un gen, podemos generar una mutación en otro o Presiones inevitables para utilizar la modificación de la línea germinal en la eugenesia.
Definición realista de Terapia Génica	Introducción con fines terapéuticos, de material genético en algunas de las células somáticas del ser humano “adulto” (considerando como tal al recién nacido, no en el feto). Pero esto no sería curar al gen, sino curar mediante el gen. Es una definición menos ortodoxa, pero más realista (hasta ahora).
PROBLEMAS A LOS QUE SE ENFRENTA LA TERAPIA GÉNICA	Problemas éticos propios de este tratamiento enfermedades que es posible tratar ¿Cómo obtenemos y manipulamos el gen terapéutico? ¿Cómo introducimos el gen? Métodos de introducción del gen (vectores) ▪ ¿Cuál es la eficacia de la introducción? ▪ ¿Cuál es la seguridad del proceso? ▪ ¿Qué células pueden ser modificadas? o¿Cuál es la regulación adecuada de un transgén? o Silenciamiento del transgén y/o rechazo del producto.
Qué enfermedades se pueden tratar?	1) Monogénicas. Siguen herencia mendeliana. El problema es que antes solamente se podría introducir genes (en AR por pérdida de función), ahora podemos también actuar en las ganancias de función gracias a los RNA's de silenciamiento. 2) Enf. Complejas Genéticas. Muchos genes y muchos factores ambientales que pueden modificar la predisposición. Por eso se hace una "Augmentation" 3) Enf. genéticas adquiridas. (SIDA, Burkitt, HB HC..)
Protocolos	Cáncer, más del 60% de los protocolos. Luego las CV (8%), infecciosas y monogénicas < 10% por el poco interés que suscitan en fq para las farmaceúticas. Los tipos de genes transferidos en la terapia génica, lo más habitual son los antígenos (20%) y las citoquinas (16%)
¿Cómo es el gen que se introduce?	En el genoma normal tenemos intrones y exones. Meterlo todo sería una locura. Lo que se hace es coger el mRNA del gen a expresar, se hace la hebra de DNA complementaria (cDNA) y será la que se introduuzca con unas secuencias reguladoras muy sencillas (unas de algún virus simple que conozcamos que simplemente expresen la secuencia)
¿Cómo se introduce el gen?.	-In Vivo -Ex Vivo
Localización y expresión del transgén	Una vez introducido, el gen puede integrarse en el genoma (cromosomal) y será permanente (MUTAGÉNESIS INSERCIONAL), o quedarse fuera (localización extracromosómica), formando un episoma, con un efecto transitorio que al cabo del tiempo desaparecerá.
Características ideales de un vector	-Producción fácil y de elevada concentración -No inmunogénico -Direccional (Se enfoque en las células que nos interesa y no en otras) -Se introduce en las células que están en división -Integra el trasgen (no en forma episomal)
Métodos de transferencia de genes	Transfección (PLÁSMIDO BACTERIANO) Transducción (VIRUS)
Transfección	La transfección se caracteriza porque se inserta el DNA complementario dentro de un plásmido bacteriano que permitirá a dicha secuencia de interés utilizar la maquinara de replicación bacteriana para poder replicarse. Además suele estar asociado a un cassete de expresión que indica a la maquinaria de formación de RNA que ha de empezar por ahí. Puede entrar por vesículas (need fosfato cálcico), microinyecciones o a través de la gene gun
Transducción	Se usan vectores virales como retrovirus, lentivirus (derivado del VIH) adenovirus, y adenoasociados. Se crea una célula empaquetadora que tiene en su genoma los genes de producción de proteínas víricas y empaquetado (se las hemos quitado al virus). Ahora a ese virus le ponemos la secuencia genómica del gen terapéutico. Cuando introducimos el virus (no es patológico, solo produce la proteína terapéutica) este se replica en la maquinaria vírica que está en el interior de las células empaquetadoras.
Retrovirus	o Ventajas ▪ Los genes se integran en el genoma de la célula huésped resultando en una modificación estable ▪ Infectan únicamente células que se dividen o Inconvenientes ▪ Los genes se integran al azar, con riesgo de mutagénesis ▪ No pueden infectar células que no se dividen ▪ No pueden prepararse a concentraciones altas
Problemas de la transducción	Podría producirse una recombinación dando lugar a un virus infectivo o competente. (Vectores de primera generación) Luego tenemos otro tipo de vectores, son los vectores de segunda generación que tienen mutaciones que inhabilitan la posibilidad de poder replicarse. Los de tercera generación además de evitar la autoreplicación de los virus, ha permitido evitar que se desarrolle una recombinación. Pueden dar una fuerte respuesta inmune. TETRACICLINAS
Adenovirus	o Ventajas ▪ No producen infecciones graves ▪ Pueden contener una cantidad de DNA considerable ▪ Pueden infectar células que no se dividen ▪ No se integran y no hay riesgo de mutagénesis o Inconvenientes ▪ Provocan fuertes reacciones inmunes ▪ No se integran y producen una modificación transitoria (es decir, su efectividad era más breve; además, cuando el gen deja de tener efecto hay que tratar el adenovirus, pero se suele tratar bien).
Virus Adenoasociados	o Ventajas ▪ No son patógenos ▪ Los genes se integran en sitios concretos del genoma ▪ Se integran y producen una modificación estable ▪ Pueden infectar células que no se dividen o Inconvenientes ▪ Sólo pueden contener una cantidad de DNA pequeña
DNA Desnudo	o Ventajas ▪ No se transfiere otro DNA que el que se desea o Inconvenientes ▪ Transferencia muy poco eficaz ▪ La modificación es transitoria
Liposomas	o Ventajas ▪ No contienen otro DNA que el que se desea transferir ▪ No provocan respuestas inmunes y pueden transferir una gran cantidad de DNA o Inconvenientes ▪ Transferencia poco eficaz ▪ Producen una modificación transitoria
TTO Terapia génica Hipercolesterolemia Familia	Se sacan hepatocitos del Hígado, se tratan con colagenasa, se hace una transfección/transducción y se reinsertan (El sistema inmune les acababa eliminando)
TTO FQ (CFTR)	Se trató de solucionar con adenovirus en las vías respiratorias (porque se producía afectación de las vías) pero lo adenovirus infectaban (recordemos que producen patología) y además el epitelio respiratorio estaba perfeccionado para producir eliminación de los mismos. Había que transfundir todas las células y además se producía una respuesta inmunitaria muy fuerte.
TTO Genético del Cáncer	Las posibilidades del tratamiento del cáncer con terapia génica incluyen algunas formas como: -Muerte de células cancerígenas -Activación de genes supresores de tumores -Estimulación de respuesta inmune -Supresión de angiogénesis -Virus oncolíticos. (o se replican sólamente en el interior de las células tumorales, por lo que los revientan. O se unen solamente a la superficie de estos)
HVS1716 herpes	(Virus del herpes simple mutante), que fue el primero en usarse. Le falta un gen que le impide replicarse en células diferenciadas y que no se dividen. Se usaba para hacer transducción, se les metía a las células tumorales un canal de ioduro y después se les daba ioduro como quimioterápico.
OncoVEX GM-CFS (Herpes)	Este tiene 5 modificaciones. 1-Por un lado, no puede replicarse en células normales. 2-Por otro lado, sí que se puede replicar en células tumorales por lo que las podría matar. 3-Además segrega una interleucina, que atrae a los macrófagos y a las células dendríticas; estas captan los antígenos que tienen alrededor que son los antígenos tumorales y las presentan para que puedan ser atacadas por los linfocitos T. De manera que esta era la idea: aumentar la respuesta inmune del paciente.
DEFICIENCIA DE ADENOSINA DESAMINASA	Respecto de la deficiencia de ADA-SCID vemos que se producen las modificaciones relativas con terapia génica para solucionar la deficiencia de linfocitos pero con dicha modificación/inserción/transducción se produce una activación del protooncogen LMO2. Es por eso que se comenzó a utilizar otro tipo de vectores virales los cuales son más seguros porque se insertan no por delante del gen sino en el medio. Eso hace que sean más específicos de una secuencia concreta.
CÉLULAS TARGETED T CD19	Los enfermos que pueden participar en estos ensayos no son cualquiera, sino por ejemplo aquellos que padecen leucemia linfoblástica aguda pero que hayan tenido una recidiva (no sirven para la aparición inicial de la enfermedad porque en esos casos el tratamiento convencional es efectivo). 19 niños de 22 afectados de ALL fueron curados (cuando se les hizo el seguimiento a los cinco años estaban libres de la enfermedad).
NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC	Se utilizan mucho para reconocer secuencias de DNA. Son enzimas de restricción artificiales creadas a partir de la fusión del dominio dedo de zinc de unión al ADN con un dominio de ruptura de ADN. Se pueden modificar los dedos de zinc de forma que reconozcan una secuencia específica cercana a la mutación causante de la enfermedad e introducir una secuencia de DNA homóloga sin la mutación en la célula para que se produzca una recombinación que de cómo resultado eliminar la mutación (curar el gen). Esta recombinación no se produce en el 100% de los casos, pero sí en un alto porcentaje. Algunos problemas son que no se pueden construir unas nucleasas con dedos de Zinc para cada enfermedad porque es teóricamente muy difícil y aún más en la práctica.
TALEN Transcription activator-like effectors nucleases	El funcionamiento es el mismo pero tienen la ventaja de que cada uno de los motivos reconoce un par de bases, por lo que son más fáciles de construir que los dedos de Zn. Lo ideal sería que reconociesen secuencias cercanas a la mutación, de manera que cortaran esa zona del DNA y se reparara por recombinación homóloga. Se ha utilizado en la epidermólisis bullosa o ampollosa mediante células madre implantadas en la mano. También se ha usado para tratamientos de leucemia, pero en algunas personas no se pueden obtener suficientes linfocitos T por lo que era necesario coger linfocitos T de donante y modificarlos genéticamente para evitar el rechazo.
CRISPR	Para reconocer una secuencia de bases lo mejor es otra secuencia de bases. Es más sencillo que los TALEN y los dedos de zinc. Es un sistema de memoria ante infecciones de virus. Nucleasa Cas9 (CAS: crispr associated genes): es capaz de cortar DNA en zonas muy específicas guiadas por una molécula de RNA que podemos sintetizar como nosotros queramos. Por tanto la corrección va a ser muy segura.

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