SUSCEPTIBILIDAD DE CÁNCERES	1-Los esporádicos están influidos mayoritariamente por el ambiente (demostrado en estudios con gemelos) 2-los hereditarios por la genética 3-los familiares por una susceptibilidad genética a factores ambientales (los genes “cargan el arma” y el ambiente “aprieta el gatillo”).
PENETRANCIA	En los cánceres hereditarios suelen ser de origen monogénico con penetrancia muy alta En los cánceres de origen familiar (predisposición genética a ser alterados por factores ambientales) suele ser debido a múltiples genes de baja penetrancia.
ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN	Se seleccionan un grupo de casos, otro grupo de controles, y ver las diferencias entre ellos. En estos estudios hay que buscar variantes genéticas candidatas SNPs • Método directo: SNP elegido es la variante causal de baja penetrancia. Se ve quién la porta y quién no la porta. • Método indirecto: los SNPs elegidos son cercanos a la variante, en desequilibrio de ligamiento.
PROBLEMAS DE LOS ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN	Los problemas de estos estudios son: - La interpretación de los resultados - La limitación del número muestral - Las falsas asociaciones (falsos negativos y positivos).
tagSNP's	SNP's que se heredan juntos por estar en el mismo haplotipo
DIAGRAMA DE ESTUDIO DE LOS SNP'S	4 proyectos: 1) Proyecto genoma humano 2) HapMap (Maplas de haplotipos) 3) Tecnologías de identificación de SNP's 4) Estudios de casos y controles / cohortes masivos
PIROSECUENCIACIÓN	Dentro de la amplificación por PCR dentro de un segmento concreto del DNA (se determina con el oligonucleótido que hayamos introducido) los nucleótidos libres al unirse liberan luz de una longitud de onda determinada.
ILLUMINA (SOLEXA) = TERMINADORES REVERSIBLES	Las hebras de ADN y los primers se pegan a un portaobjetos y se lleva a cabo una amplificación por la polimerasa, de forma que se crean colonias locales de ADN o “clusters de ADN”. Una cámara recoge la fluorescencia etiquetada de los nucleótidos y determinará qué nucleótido es el que se ha unido a esa posición. Los pasos consisten en la fragmentación del ADN y ligación de adaptadores. Luego hay un paso de amplificación en una superficie sólido: “flow cell”, donde luego se da la reacción de secuenciación.
Ion Torrent semiconductor	Se basa en la detección de iones de hidrógeno que se generan durante la polimerización del ADN. Posee micro-pocillos en los que se insertan la cadena de ADN a secuenciar y se inunda con un único tipo de nucleótido, produciéndose la liberación de un pirofosfato y una carga positiva en forma de iones de hidrógeno.
Secuenciación por ligación (SOLid)	Es otro método que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa. Utiliza un reservorio de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posición secuenciada, por su secuencia específica produce una señal correspondiente a la secuencia complementaria. El proceso de secuenciación es realmente innovador, dándose distintas rondas de hibridación y ligado con 16 dinucleótidos marcados con 4 colores distintos. Empleando un código de colores, cada posición es evaluada dos veces, lo que aumenta drásticamente la discriminación entre errores de secuencia y polimorfismos de SNPs.
CONCLUSIONES	Los métodos de secuenciación denominados de nueva generación a diferencia del método Sanger, han logrado desarrollar una secuenciación efectiva a bajo coste; pero se necesitan equipos más sofisticados. La secuenciación SOLID genera un porcentaje de error no detectable con la presencia de repeticiones de bases.   El método más utilizado es la PCR en emulsión y la clonación in vitro para aislar moléculas de ADN y generar muchas copias.
Estructura de los genes	Región reguladora: Promotor Región estructural: 5'UTR + EXón (n) + Intrón (n) + 3'UTR Exón: ATG comienza, TGA/TAA/TAG finaliza
Tipos de mutaciones ante las que podemos encontrarnos	Podemos encontrar mutaciones de los siguientes tipos: 1) Mutaciones puntuales 2) Mutaciones de la región promotora 3) Mutaciones por reordenamientos genómicos
Tipos de mutaciones "puntuales"	5 Clases (IMP) 1 y 2: Polimorfismos 3: UV PUEDE TENER SIGNIFICADO INCIERTO NO EXPLICAR A LA FAMILIA HASTA ESTAR SEGUROS 4: Mutaciones probablemente Patológicas 5: Mutaciones SEGURO Patológicas. Codones de STOP
MUTACIONES DE SPLICING: Procesamiento del ARNm	Inicio exón AG Final del exón GT
ANÁLISIS MOLECULAR DE BRCA1 Y BRCA2	1. Extracción y cuantificación del ADN y ARN de la sangre que nos llega. 2. PCR multiplex con primers marcados y formación de heteroduplex. Secuencia codificante e intrónica flanqueante: 73 fragmentos-23 multiplex PCR 3. Análisis de heteroduplex mediante electroforesis capilar y análisis de patrones 4. Secuenciación de fragmentos con movilidad alterada.
Extracción y cuantificación del ADN y ARN de la sangre que nos llega.	Llega sangre con EDTA (Anticoagulante), firma de consentimiento, eliminación de los eritrocitos (no tienen núcleo). Limpieza de contaminantes. 1ml de sangre 200 microlitros de DNA.
PCR Múltiplex con primers marcados y formación de heterodúplex	PCR Simple. Tener en cuenta que diferentes primers pueden tener diferentes condiciones de funcionamiento. PCR ingredientes: • DNA molde • Oligonucleótidos sintéticos iniciadores • dNTPs: nucleótidos sueltos que van a ser la materia prima para que la polimerasa copie • Polimerasa termorresistente (Thermus aquaticus) • Cl2Mg 1. Desnaturalización a 94-96º. Se produce la separación de la doble hélica 2. Unión de primers a temperatura variable (50-60º). Esta sería la temperatura de ali-neamiento o de hibridamiento de los primers, es decir, aquella que permite que los oligonucleótidos se unan. 3. Extensión a 72º. A esta temperatura la polimerasa empieza a copiar esa parte del genoma. 4. Repetir las tres etapas anteriores 25-40 ciclos
Análisis de heterodúplex con electroforesis capilar y análisis de patrones	Desnaturalizar 98º + Renaturalizar (enfriar hasta 25º) • Si DNA normal Homodúplex • Si DNA anormal Heterodúplex
Patrones de mutaciones de sustitución de nucleótido (SNSs)	• Sustitución de nucleótido: mutaciones más frecuentes en enfermedades genéticas. • Detección complicada • Detección de más de 180 mutaciones • Patrones muy variables: 1 pico con hombros a 4 picos diferenciados
MLPA	Los MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification) son sondas que se pegan a los exones, son kits comerciales. • Análisis de grandes deleciones/inserciones en genes de enfermedades hereditarias • Diagnóstico de anomalías cromosómicas: síndrome de Down • Análisis de perfiles tumorales: Copy Number Variation • Cuantificación ARNm: apoptosis, inflamación • Estudios de metilación del ADN: hay MLPAs específicos de metilación, si el pro-motor está metilado no se pegan mientras que si no están metilados se pegan, se verían picos o no interpretando así si el promotor está o no metilado.
CONSEJO O ASESORAMIENTO GENÉTICO en CA	Procedimiento destinado a informar a una persona sobre las posibles consecuencias para él o su descendencia de los resultados de un análisis o cribado genéticos y sus ventajas y riesgos y, en su caso, para asesorarla en relación con las posibles alternativas derivadas del análisis. Tiene lugar tanto antes como después de una prueba o cribados genéticos e incluso en ausencia de los mismos
ETAPAS CONSEJO O ASESORAMIENTO GENÉTICO en CA	1-Identificación de individuos o familias de riesgo + valoración del riesgo. 2-Consejo genético pre-test: información gen-mutación-herencia 3-Firma del consentimiento informado 4-Realización de test genético 5-Consejo genético post-test 6-Seguimiento
Asesoramiento previo a la prueba genética:	• Se debe construir y evaluar el árbol genealógico • Obtener la historia médica personal y familiar • Verificar la historia familiar • Proporcionar información al paciente de los riesgos, beneficios y limitaciones del estudio genético • Escoger al mejor candidato para realizar la prueba. El caso índice SIEMPRE el primer familiar enfermo
Resultados del estudio genético:	Resultado positivo: identificación de una mutación con significado patogénico; es portador de la mutación y explica los casos. Se realiza un estudio de portadores Resultado verdadero negativo No concluyente: No encontramos mutación en los genes buscados. Resultado de significado desconocido: Se ha visto una mutación grado 3 de la que se desconoce la verdadera implicación en el desarrollo de la patología. Se estudia a los posibles portadores y si se repiten casos con mutación y patología se puede llevar a investigación.
MODELO GAIL	• Incorpora: Edad actual, Historia reproductiva, número de biopsias de la mama (y la presencia de hiperplasia atípica), antecedentes familiares con cáncer de mama sólo en familiares de primer grado (hasta un máximo de dos). Es el método para estimar el riesgo de cáncer de mama cuando no hay historial en la mujer. • No incorpora: Antecedentes familiares de otros tipos de cáncer (ovario), cáncer de mama en parientes de segundo grado, cáncer de mama en parientes paternos. La edad al diagnóstico cáncer de mama en familiares.
MODELOS PREDICTIVOS	Modelo BRCAPRO para cáncer de mama: estima el riesgo, introduciendo los datos del paciente. De interés cuando el árbol no es muy informativo, para decidir si lo introducimos o no en el estudio de material genético. • Familiares con cáncer de mama y familiares sin cáncer de mama. • Cuando apareció el cáncer de seno u ovario en familia materna y paterna. • Edad del diagnóstico, edad actual, edad de fallecimiento de los familiares. • Antecedentes de judíos Askenazi (tiene una mutación fundadora de BRCA). • Si le han quitado los ovarios y si tiene receptor al cáncer de mama.
Modelo MMRpro para cáncer colorrectal	• Historia personal y familiar de CCR y cáncer de endometrio • Edad de diagnóstico (o edad actual de los familiares sanos) • Resultados del estudio MMR • Predice probabilidad de una persona de tener mutaciones deletéreas en los genes MLH1, MSH2 y MSH6. • Estima el riesgo de cáncer en personas no afectadas, portadores, no estudiados y con resultados no informativos,
Modelo PREMM 1,2	• Historia personal y familiar de CCR, cáncer de endometrio y otros cánceres asociados. • Edad de diagnóstico. • Predice la presencia de mutaciones en los genes MLH1 o MSH2

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