Respiración celular	Al hablar de respiración celular, nos referimos a los procesos celulares que al oxidar los combustibles biológicos, liberan CO2, consumen oxígeno y generan ATP.
Fase 1 de la respiración celular	• Se produce la oxidación de los combustibles metabólicos con transferencia de electrones a las coenzimas aceptoras NAD+ y FAD que se reducen a NADH y FADH2, respectivamente. • En esta Fase, la mayoría de los combustibles metabólicos (glúcidos, ácidos grasos y muchos aminoácidos) convergen en la generación del grupo acetilo (de 2 carbonos) activado: el acetil-CoA.
Fase 2 de la respiración celular	• En la Fase 2 ocurre la oxidación completa del grupo acetilo del acetil-CoA a CO2 (la forma más estable del carbono) en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (o CAT, o ciclo de Krebs, o ciclo del ácido cítrico) y también aquí la energía se almacena principalmente como NADH y FADH2. • La Fase 2 ocurre exclusivamente en las mitocondrias.
Fase 3 de la respiración celular	• En la Fase 3, la energía obtenida a partir de la oxidación de los combustibles (en forma de coenzimas reducidas) es convertida en la energía de las uniones del ATP a través del proceso de fosforilación oxidativa. • Los electrones se transfieren desde el NADH y el FADH2 (las coenzimas se reoxidan) al oxígeno, a través de la cadena de transporte de electrones. • Este proceso genera un potencial electroquímico en la forma de un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna que puede utilizarse para la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico (Pi).
Principal combustible metabólico del organismo	Ácidos grasos
¿De dónde proviene el piruvato?	• El piruvato es el producto final de la glucólisis aeróbica que ocurre en el citosol y también de la degradación de algunos aminoácidos como alanina, serina y cisteína. • El destino del piruvato depende del tejido en el que se produce y de su estado metabólico. • Además de ser sustrato del complejo de la piruvato deshidrogenasa, el piruvato puede ser utilizado en otras vías metabólicas como por ejemplo: a) transaminación a alanina, b) carboxilación para generar oxaloacetato (sustrato gluconeogenético) y c) reducción a lactato (glucólisis anaeróbica).
Piruvato Deshidrogenasa	• Piruvato + NAD+ + CoA-SH -----> Acetil-CoA + CO2 + NADH + H+ • Esta enzima se localiza exclusivamente en mitocondrias, en altas concentraciones en tejidos como el músculo cardíaco y el riñón.
Complejo de la PDH	• El complejo de la piruvato deshidrogenasa está compuesto por tres actividades enzimáticas, denominadas: - Piruvato deshidrogenasa propiamente dicha (E1), - Dihidrolipoil transacetilasa (E2) y - Dihidrolipoil deshidrogenasa (E3).
Coenzimas de la PDH	•Cinco coenzimas o grupos prostéticos participan en la reacción de la piruvato deshidrogenasa: - Pirofosfato de tiamina, - Ácido lipoico, - Coenzima A, - FAD y NAD+ •La E1 tiene covalentemente unido pirofosfato de tiamina, la E2 tiene covalentemente unido ácido lipoico y la E3 tiene covalentemente unido FAD.
Mecanismo de reacción de la PDH	De la descripción del mecanismo de la reacción se desprende que existe una activa participación de grupos tioles en el mecanismo catalítico de la enzima y por lo tanto agentes que oxiden o formen complejos con los grupos tioles serán potentes inhibidores del complejo enzimático. Por ejemplo, el arsenito.
Regulación de la PDH (alostérica)	⛔ Acetil-CoA ⛔ NADH
Regulación de la PDH (modificación covalente)	• El complejo existe en dos formas: una forma activa (desfosforilada) y otra forma inactiva (fosforilada). • La inactivación del complejo es catalizada por una proteína quinasa dependiente de ATP-Mg2+ que está fuertemente unida al complejo. • La reactivación del complejo está catalizada por una fosfoproteína fosfatasa que cataliza la desfosforilación del complejo en forma dependiente de Mg2+ y de Ca2+. Finalmente, se ha demostrado que la administración de insulina puede activar a la piruvato deshidrogenasa del tejido adiposo y que las catecolaminas (como la adrenalina) pueden activar a la enzima del tejido cardíaco.
Proteína quinasa dependiente de ATP-Mg2+	⛔ ADP, cuyos niveles aumentan cuando aumenta el consumo de ATP ⛔ CoA-SH ⛔ NAD+ Por lo tanto, cuando se produce un aumento en las relaciones NADH/NAD+ o acetil-CoA/CoA-SH (como por ejemplo durante la β-oxidación de ácidos grasos), la actividad del complejo enzimático disminuye marcadamente ⛔ Piruvato En presencia de altas concentraciones de piruvato, la quinasa estará inhibida y el complejo tendrá su máxima actividad.
Destinos metabólicos del Acetil-CoA	a) oxidación completa del grupo acetilo en el CAT, con generación de energía. b) conversión a cuerpos cetónicos (en determinadas situaciones metabólicas, en el ayuno y exclusivamente en el hígado): acetoacetato y β-hidroxibutirato. c) transferencia de acetilos al citosol y la subsecuente biosíntesis de moléculas complejas como ácidos grasos de cadena larga y esteroles (en la saciedad).
¿Dónde se realiza el Ciclo de Krebs?	Todas las enzimas del ciclo se localizan en la mitocondria, lo que coincide con la localización del complejo de la piruvato deshidrogenasa y de las enzimas de la β-oxidación, las dos fuentes principales de acetil-CoA.
Función del CAT	Una de las funciones principales del ciclo es la generación de equivalentes de reducción, que se utilizan para generar energía (ATP), en la secuencia de transporte de electrones y fosforilación oxidativa, procesos que también ocurren en las mitocondrias.
Energía del CAT	Aproximadamente 2/3 del NADH y del FADH2 generados en todas las vías de oxidación de combustibles provienen del CAT.
Primera reacción de oxidación de Acetil-Coa en el CAT	• Acetil-CoA + Oxaloacetato + H2O ----> Citrato + CoA-SH • Citrato sintasa:
Paso 2 de la oxidación de Acetil-CoA en el CAT	• Citrato <---> Cis-Aconitato <---> Isocitrato • Aconitasa, requiere Fe2+ • En el equilibrio: 90% citrato, 3% cis-aconitato y 7% isocitrato
Paso 3 del CAT	• Isocitrato -----> α-cetoglutarato • Isocitrato deshidrogenasa: ✅ADP y AMP ⛔ ATP y NADH • En este paso se produce el primero (de los 2) CO2 y se genera NADH + H+
Paso 4 del CAT	• α-cetoglutarato -----> Succinil-CoA • α-cetoglutarato deshidrogenasa: ⛔ ATP, GTP, NADH y Succinil-CoA ✅ Aumento en la concentración de Ca2+ • En esta reacción se genera la segunda molécula de CO2 y el segundo NADH + H+
Paso 5 del CAT	• Succinil-CoA <-----> Succinato • Succinil-CoA sintetasa o succinato tioquinasa • GDP + Pi --> GTP
Paso 6 del CAT	• Succinato -----> Fumarato • Succinato deshidrogenasa ⛔ Malonato y oxaloacetato ✅ Succinato • Dada su similitud estructural con el succinato, el malonato es un inhibidor competitivo de la enzima. • FAD --> FADH2
Paso 7 del CAT	• Fumarato <-----> L-Malato • Fumarasa
Paso 8 del CAT	• Malato <-----> Oxaloacetato • Malato deshidrogenasa • NAD+ --> NADH + H+ • La reacción es fuertemente endergónica en la dirección de formación de oxaloacetato. • Sin embargo, las reacciones siguientes catalizada por la citrato sintasa y otras, permiten la formación del oxaloacetato pues mantienen sus niveles muy bajos, ya que es utilizado en las siguientes reacciones. • Además, el NADH producido se oxida rápidamente en la cadena de transporte de electrones.
FADH2	El FADH2 en la succinato deshidrogenasa está covalentemente unido y no se disocia de la enzima que se encuentra en la membrana mitocondrial interna donde los electrones del FADH2 son cedidos a la coenzima Q, un intermediario de la cadena de transporte de electrones. Todas las otras enzimas del CAT se encuentran en la matriz mitocondrial.
Diferencias entre FAD y NAD+	• A diferencia del FAD, el NAD+ está generalmente libre en solución, se une a la deshidrogenasa y acepta electrones y luego se libera y difunde. • Por lo tanto, el NAD+ y el NADH funcionan más como sustratos y productos que como coenzimas. • Esta característica le permite al NADH ser un regulador de la función celular. El NADH generado por una deshidrogenasa puede inhibir a otra si no es reoxidado por la cadena de transporte de electrones. La regulación del ciclo por la relación NADH/NAD+ es parte del mecanismo que permite coordinar la oxidación de combustibles con la utilización de ATP.
Coenzima A	• La CoA-SH es una coenzima de acilación y participa en reacciones en las que se forma un enlace tioéster con un grupo acilo • La energía liberada por la ruptura del tioéster cumple dos funciones en el CAT: provee la energía para la generación de GTP y hace que la entrada del acetil-CoA al ciclo sea más favorable termodinámicamente.
Balance energético del Ciclo de Krebs	Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O -------> 2 CO2 + CoA-SH + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP
Ganancia neta del CAT	La ganancia neta para la oxidación de cada mol de acetil-CoA en el CAT es de 10 moles de ATP
Regulación del CAT	• La velocidad de utilización de ATP es la fuerza fisiológica primaria impulsora del ciclo. • Existen dos señales principales de la velocidad de utilización de ATP: a) el estado de fosforilación de los nucleótidos de adenina, que se refleja en los niveles de ATP y ADP, y b) el estado de reducción del NAD+ , reflejado en la relación NADH/NAD+
Suma de la concentración de nucleótidos de adenina y la de NAD+	• Dentro de la célula y aún dentro de la mitocondria, la suma de la concentración de nucleótidos de adenina (AMP, ADP y ATP) y la de NAD+ (NAD+ y NADH) son relativamente constantes. • Sin embargo, la velocidad de interconversión de los nucleótidos de adenina y la velocidad de oxidación y reducción de las coenzimas varían considerablemente entre distintas situaciones metabólicas. • Por lo tanto, un aumento en la utilización de ATP resultaría en una pequeña disminución en sus niveles y un aumento en la concentración de ADP. • Análogamente, un aumento en la oxidación de NADH por la cadena de transporte provocaría un aumento en el contenido de NAD+ y una disminución en el de NADH.
Deshidrogenasas	• Dado que las deshidrogenasas principales son dependientes del aporte continuo de NAD+ y de FAD, sus actividades están estrictamente controladas por la cadena respiratoria que es responsable de su oxidación y que está obligatoriamente acoplada a la generación de ATP. • De este modo, la actividad del ciclo es muy dependiente del control respiratorio, que a su vez está afectado por el aporte de ADP + Pi y de oxígeno.
Control grueso del CAT	Un agente inhibitorio o una condición metabólica que interrumpa el aporte de oxígeno, el aporte continuo de ADP o la fuente de equivalentes de reducción, inhibirán la actividad del ciclo.
Pasos limitantes	La regulación de la velocidad de una vía metabólica ocurre sobre las enzimas que catalizan los pasos limitantes de la velocidad, o sea los más lentos.
Enzimas regulatorias del CAT	La regulación del ciclo ocurre a nivel de dos enzimas: la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa. Ninguna de estas enzimas cataliza la primera reacción del ciclo, y por lo tanto no afectan directamente la velocidad de entrada del acetil-CoA.
Isocitrato deshidrogenasa	✅ ADP ⛔ NADH En ausencia de ADP exhibe cooperatividad positiva, cuando el isocitrato se une a la primera subunidad, las otras subunidades se convierten a una conformación activa. En presencia de ADP cambia la conformación de todas las subunidades de modo que el isocitrato se une más rápidamente y el Km aparente cambia a un valor mucho menor.
α-cetoglutarato deshidrogenasa.	⛔ NADH ⛔ Succinil-CoA • Ambas enzimas, la isocitrato deshidrogenasa y la α-cetoglutarato deshidrogenasa, se activan por aumento en la concentración de Ca2+ mitocondrial.
Regulación del CAT en contracción muscular	En el músculo esquelético en contracción y posiblemente en otros tejidos musculares, la liberación de Ca2+ del retí**** sarcoplásmico y el aumento en la concentración mitocondrial de Ca2+ durante la contracción puede proveer una activación adicional de estas enzimas en una situación metabólica en la que el ATP se está hidrolizando rápidamente (contracción muscular).
Citrato sintasa	La enzima citrato sintasa es una enzima simple en tejidos de mamíferos y no se regula alostéricamente.
Equilibrio malato/oxaloacetato	Cuando la isocitrato deshidrogenasa se activa, la concentración de citrato disminuye. Dado que el equilibrio malato-oxaloacetato favorece al malato, la concentración de oxaloacetato es muy baja dentro de la mitocondria, por debajo del Km aparente para la citrato sintasa. Cuando la relación NADH/NAD+ disminuye, la relación de oxaloacetato/malato aumenta. El aumento en los niveles de oxaloacetato aumenta la velocidad de la reacción de la citrato sintasa.
Otros factores involucrados en la regulación	Además de lo ya mencionado, otros factores están involucrados en la regulación de la actividad del CAT. Por ejemplo, el aporte de sustratos como las unidades de acetilo que provienen del piruvato o de ácidos grasos, es un factor crucial para determinar la velocidad del ciclo. Por lo tanto, la regulación de la piruvato deshidrogenasa tendrá un efecto importante en la velocidad del ciclo. De modo similar, cualquier mecanismo que regule los procesos de transporte y la β-oxidación de ácidos grasos será un determinante efectivo de la actividad del ciclo.

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