Biotecnología I

Falso. Un ejemplo es el medio de cultivo sintético para células madre o pluripotentes inducidas, en cuyo caso el suero podría inducir una diferenciación no deseada.

Verdadero. Son 5 veces más estables que los ARNm.

Falso. El motivo es de 33-35 aa. El resto es verdadero.

Falso. Permite secuencias más cortas.

Falso. MALDI, a diferencia de lo que dice la consigna, consiste en la ionización de proteínas en fase gaseosa.

Falso. Las levaduras son metilotrofas, es decir, pueden crecer con metanol como fuente de carbono.

Sí - Se deriva directamente de un explante de un animal.
No - Crece durante un número ilimitado de generaciones.
Sí - Contiene una población de células muy heterogénea.

Sí - Preparación del inó****.
No - Esterilización del medio de cultivo
No - Purificación del producto

Los miRNA con la misma semilla son de la misma familia ---> pueden regular los mismos genes.
Los miRNA casi idénticos se nombran con un sufijo alfabético.
Los miRNA casi idénticos pero que provienen de diferente loci se nombran con sufijo numérico ---> sus funciones varían.

Depende de la polimerización. La muestra se fragmenta y se le incorporan adaptadores de secuencia conocida. La muestra se hibridiza en un chip con millones de adaptadores en su superficie. Cuando el molde adaptador encuentra complementariedad de cases con el adaptador, las secuencias a secuenciar quedan unidas. Luego se realizan algunas rondas de polimerización, formandose puentes entre los adaptadores. En cada ciclo se forman clusters de la misma secuencia por la polimerización. Para secuenciar, se basa en los terminadores de Sanger, pero unidos a fluoroforos diferentes y reversibles. Entonces, se agrega un terminador en cada spot, la polimerización se corta y el equipo mide cuál fue la base añadida; luego se desbloquea el terminador y se realiza una nueva polimerización agregando una nueva base, lo cual se repite hasta secuencia completamente el fragmento de cada spot.

Cuerpos de inclusión, citoplasma, espacio periplásmico.

-Debe ser genéticamente estable.
-Tiene que crecer rápidamente y producir el producto deseado en un corto período de tiempo.
-Debe crecer en un medio de cultivo relativamente barato y disponible en grandes cantidades.

-Tienen forma circular.
-Son más estables que el ARNm.
-No tienen poliA.
-Son poco frecuentes.
-Están muy conservados entre especies.
-Suelen estar en el citoplasma.
-Pueden provenir de diferentes intrones, exones y ser mezclas de ellos.
-Se forman durante el splicing.

Son cepas de e. Coli creadas para resolver el problema de la baja expresión de ciertos ARNt. Para ello se introdujeron plásmido que codifican para dichos ARNt en cepas BL21 de e. Coli, logrando producir varias hormonas humanas.

Falso. Depende de qué tipo de célula sea y si es capaz de excretar el producto al medio o si la guarda dentro del organismo (por ej, cuerpos de excusión o espacio periplasmaticos).

Son cepas de e. Coli creadas para resolver el problema de los puentes S-S. Las bacterias difícilmente crean este tipo de puentes, entonces se mutageneizaron enzimas capaces de crearlos en cepas de e. Coli comunes. El resultado fue bacterias que crean proteínas con puentes S-S correctamente, pero en una escala menor que los humanos.

1- Separación de las células del medio de cultivo. Si el producto se encuentra en el medio, las células pueden desecharse. Si el producto se encuentra en la célula, el medio puede desecharse.
2- Recuperación del producto. Debe tener poco impacto en el porcentaje final de recuperación.

1- Elección del agente biologico: bacterias, levaduras, cultivos celulares, plantas o animales completos.
2- Optimización del medio de cultivo.
3- Optimización del proceso de fermentación.

Cultivo celular primario: proviene directamente del explante del animal. Solo sobrevive un tiempo finito. Requiere disgregación y selección del tipo celular deseado, dado que presenta una población celular muy heterogénea. Su subcultivo da lugar a las líneas celulares.

Estas células son más pequeñas, más redondeadas, menos adherentes y con una relación mayor núcleo/citoplasma. Presentan crecimiento rápido y número de cromosomas aneuploides, reducción de requerimiento de suero y anclaje reducido. Son más proclives a crecer en suspensión y tienen capacidad de crecer hasta una densidad celular más alta. Son diferentes fenotípicamente al tejido original y deja de expresar genes específicos del mismo.

-Tienen +200 nt.
-Regulan a nivel transcripcional.
-Son ubicuos en la célula.
-Pueden o no estar poliadenilados.
-Pueden secuestrar factores de transcripción.
-Participan del impriting.

Partimos del pri-miRNA copiado del genoma, que puede ser mono o policistronico y cuenta con cola de poliA. Este precursor se cliva con DROSHA y forma el pre-miRNA con estructura de hairpin que le da estabilidad. La exportin-5 pasa el pre-miRNA al citoplasma con gasto de ATP. Dicer lo reconoce y lo transforma en el miRNA maduro quitandole la estructura hairpin y dejandolo como un duplete. Ahí lo reconocen las Ago y lo cargan en el complejo RISC, que elige la hebra guía para inhibir o degradar ARNm. La hebra no usada se cliva.

-Independientes de DICER.
-Independientes de DROSHA.
-Dependiente de tutasas.

-
-Northern blot. Es difícil, caro y peligroso, pero permite diferenciar entre pri, pre y miRNAs maduros.
-qPCR-RT. Cuantificar los miRNAs por qPCR real time es difícil porque son cortos, y los productos de qPCR deberían tener 50 a 200 nt.
-Con stemloop primers. Se añade un stemloop primer para la retrotranscripción a cDNA y luego se realiza la qPCR utilizando sondas TaqMan o intercalante SYBR Green, ambos para medir la fluorescencia.
-qPCR con oligoT. En lugar de un stemloop primer, se usa un oligoT. El resto es similar al punto anterior.
-Array. Se realiza una retrotranscripción en una placa de 96 wells.
-Secuenciación masiva de pequeños ARNnc mediante NGS o microarray.

-NHEJ. El sistema de reparación reconoce la ruptura en el ADN y la sella pero de forma inespecífica, pudiendo cometer errores y mutaciones.
-RH. El sistema de reparación utiliza una región homóloga como molde para reparar. Es menos eficiente y probable que NHEJ, pero permite reparar específicamente si se le da un molde a la célula.

-CRISPR. Sistema de inmunidad extendido en bacterias.
-Cas 9. Nucleasa especializada en cortes doble cadena de ADN.
-gRNA. Es una construcción de laboratorio. Quimera entre el ARNcrispr y el ARNtransactivador.
-PAM. Es una secuencia de 3 nt que reconoce la Cas. Si reconoce la PAM y el gRNA es complementario, la Cas va a cortar en esa sección.

Al haber un único guía, pueden haber offtargets. Para resolver esto, se logró obtener nucleasas que realicen cortes simple cadena. Entonces deben realizarse dos plásmidos con diferentes gRNA, uno para cada hebra.

No! La edición por este sistema se hace sin introducir genes exógenos, sino modificando dirigidamente la secuencia genética.

a. El transcriptoma varía más que el genoma porque corresponde a los genes y/o ARNnc que se están expresando en un determinado momento/condiciones en un determinado tejido.

-Utiliza polimerización.
-Se pone la secuencia en 4 tubos diferentes con dideoxirribonucleotidos (sin OH en el C3 de la pentosa, detienen la reacción) y luego se procede a polimerizar.
-Una vez que se termina la polimerización, se corren los cuatro tubos en gel de poliacrilamida y las bandas visibles indican cada tipo de nucleótido.

Es una electroforesis en la cuál primero se separa la muestra compleja de proteínas por isoelectroenfoque, luego se gira 90° el gel y se separa en condiciones desnaturalizantes según la masa de las proteínas.

-Electrospray. Las moléculas se encuentran en una solución acuosa ácida.
-MALDI. Las moléculas se encuentran originalmente en fase sólida y luego se volatilizan --> pasan a fase gaseosa.

(hay más pero esta es la más importante)

Consiste en dos espectrometrías en tándem. Primero se realiza una, luego el péptido se fragmenta y se vuelve a hacer espectrometría para los fragmentos. Finalmente, el equipo analiza los fragmentos de cada péptido y los compara in sílico, o sea, con péptidos de las bases de datos que tengan la misma relación m/z.

1. Se obtienen dos tejidos en diferentes condiciones (estadío del desarrollo, condiciones ambientales, diferenciación, etc.) y se toman todos los ARNm de cada uno.
2. Retrotranscripción para obtener cDNA. Durante la reaccción se usan dNTPs marcados con sondas flourescentes de dif color para cada condición.
3. Siembra de las muestras de cDNA en el chip, donde se vana unir por complementariedad de bases con la secuencia correspondiente.
4. Se lava el cDNA que no se pegó y se analizan los niveles de fluorescencia que quedaron en el microarray.

-Primarios: estructura simple, participan de los procesos escenciales de los organismos, se producen a medida que la célula crece. Son baratos, fáciles de producir, y tienen bajo contenido de actividad biológica. Ej.: alcoholes.
-Secundarios: estructura compleja, le confieren capacidades de supervivencia especiales al MO antes condiciones determinadas. Son difíciles de producir, caros, y tienen mayor actividad biológica. Ej.: antibióticos.

-Permiten cultivo puro.
-Crecen rápidamente a altas densidades.
-Pueden usar medio líquido y barato.
-El cultivo es estable.
-Hay conocimiento de su biología molecular.

-Contaminaciones: si derivan de células tumorales pueden portar retrovirus. También pueden ser virus, priones y micoplasmas provenientes del SFB agregado.
-Inestabilidad de la línea celular (apoptosis).

-No realizan modificaciones post-traduccionales: S-S, glicosilaciones, estructuras 3D y 4D diferentes.
-Acumulación de las proteínas en cuerpos de inclusión, periplasma y citoplasma.
-Contaminación con endotoxinas bacterianas.

-Operón Trp. Simple, solo se requiere un medio sin Trp para permitir su inducción.
-Operón Lac.
-Operón pET del fago T7.

Mejoran la solubilidad de la proteína, sirven para detectar la proteína por fluorescencia, secuencias de corte, etc. Luego se puede eliminar por proteasas.

-Es un sistema costo-efectivo: rápido crecimiento, bajo costo.
-Bien caracterizadas genética y fisiológicamente.
- Eucariota: modificaciones post-traduccionales esenciales para la función proteica. La gran ventaja es la glicosilación.
-No hay posibilidad de contaminación con endotoxinas bacterianas.
-Secreta la proteína recombinante al medio extracelular. La secreción de proteínas genera rendimientos mucho mayores que en procariotas.
-Promotores fuertes disponibles.
-Es adaptable a fermentación a gran escala.
-Organismos no patógenos.
-Son metilotrofas: tienen la capacidad de usar metanol como fuente de carbono

-Bajo número de copias: son integrativos. No se logran altos niveles de expresión, pero se usan cuando la proteína podría ser mala para la levadura.
-Alto número de copias: no se integran al genoma de la levadura; y se replican usando el ORI2 q nos permite obtener muchas copias del plásmido por célula.
-Vectores episomales: no integrativos, son los más usados pero después de cierto tiempo pueden hacerse inestables a gran escala, o sea q se pueden perder con los pasajes. Para evitar q esto pase, los vectores episomales usan marcadores de auxotrofía.

-Inestabilidad de plásmidos en gran escala de los vectores episomales.
-Hiper-glicosilación de glicoproteínas que puede alterar la actividad de la proteína.
- Muchas proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular) --> se usan señales peptídicas para resolver este problema.

-Requerimientos nutricionales complejos.
-Cultivo en monocapa.
-Concentraciones de CO2 particulares
-Se debe optimizar/mejorar la productividad y biomasa (diseño de cultivo y amplificación génica), y la estabilidad de producción.

La estructura de la proteína es pequeña, de 51 aa, con 2 S-S intercatenarios y 1 intracatenario. La insulina no se sintetiza funcionalmente, sino que requiere 3 etapas: primero la pre-pro-insulina, luego se cortan obteniendo la pro-insulina y luego esta se vuelve a cortar para formar la insulina.

1. Extracción de páncreas (cerdos, bovinos).
2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales.
3. Conversión de insulina porcina en humana.
4. Fermentación de microorganismos.

-IFN β 1a es un interferón glicosilado, producido por tecnología de DNA recombinante por células CHO. La secuencia aminoacídica es idéntica a la del interferón B natural.
-IFN β 1b es un interferón no glicosilado producido por tecnología de DNA recombinante por una cepa de E. coli. Posee sutiles diferencias estructurales con el interferón.

Se vio que la proinsulina humana no era secretada eficientemente por las levaduras, entonces se diseñó el “Insulin Precursor” (IP):
-Cadena A completa.
-Cadena B con 29 aa (la cadena B carece de la treonina C-terminal).
-Ambas cadenas se producen directamente unidas o bien unidas con un un tripeptido sintético (ala, ala, lys- AAK).
-FUSIÓN: La secuencia nucleotídica se fusiona con una secuencia señal líder que guía la secreción extracelular y es removido enzimáticamente por la levadura.
- RECUPERACIÓN: El polipéptido de insulina se recupera por cromatografía de intercambio iónico.
- TRANSPEPTIDACIÓN: La “humanización” de la insulina se hace por transpeptidación mediada por tripsina en presencia de exceso de ester de treonina.
-El producto se purifica por cristalización y cromatografía.

-Papaína (ablandamiento de carne) y quimopapaína (hernia de disco) del árbol de la papaya.
-Ficina (ablandamiento de carne) de higueras.
-Bromelaína (facilita la digestión) del tallo de la planta de la piña.

Las manchas que contienen proteínas no se disuelven fácilmente en agua. A altas temperaturas, la proteína se cuaja en las fibras textiles y es más difícil de eliminar. Polvo, hollín y materia orgánica como grasas, proteínas, carbohidratos y pigmentos. Las grasas y las proteínas actúan como pegamento. Los detergentes sueltan la grasa de la tela, las proteínas permanecen en el material. Las enzimas pancreáticas son poco estables y muy caras. El descubrimiento de la subtilisina de Bacillus lincheniformis, activa bajo condiciones alcalinas permitió desarrollar un detergente de actividad óptima durante el proceso de lavado. Degradan proteínas pegadas en aa y péptidos de cadena corta. Las proteínas son desprendidas de las fibras textiles y eliminadas. Actividad óptima 50-60ºC. No necesita hervir. Esto permitió la eliminación enzimática de manchas: proteasas, lipasas y amilasas.

-Ventajas: es muy abundante, barato y versátil (puede modificarse químicamente su superficie). Se puede someter a tratamientos termoquímicos para obtener derivados de ella, los acetatos de celulosa. Estos últimos son fibras de distintos tamaños cuya parte cristalina tiene una dureza comparable a un termoestable.
-Desventajas: es un material muy sensible a la humedad, dado que tiene elevado water vapor transmission rate. Es insoluble. Los films que se obtienen no son 100% transparentes.
-Acetato de celulosa: es transparente, tiene buenas propiedades barrera y mecánicas. Sin embargo, es caro y sufre degradación térmica.

-Ventajas: es el segundo biopolímero más abundante. Tiene buenas propiedades mecánicas, es sellable e imprimible sin tratamiento superficial, sirve como barrera para gases y aromas. Es intrínsecamente antiestático, hidrosoluble y versátil (puede modificarse químicamente).
-Desventajas: material muy sensible a la humedad, elevado wwtr. Elevada densidad, procesado complicado por extrusión, fragilidad.

-Ventajas: distintas prop en función de su composición, prop mecánicas similares a poliolefinas, no tienen restos de catalizadores, son una buena barrera a los gases similares a poliésteres aromáticos, resistentes a grasas y disolventes, buena relación de estirado para procesos de soplado, estabilidad frente a la hidrólisis.
-Desventajas: muy sensibles a la degradación térmica por lo que se complica el procesado por extrusión, muy quebradizo, viscosidad en fundido muy baja.

-Ventajas: propiedades mecánicas, imprimible sin tratamiento superficial, resistente a productos acuosos y grasa, termoestable a temperatura ambiente, procesado similar a poliolefinas convencionales (extrusión, inyección y termoformado), mantiene la torsión, alta transparencia.
-Desventajas: muy quebradizo, elevada permeabilidad al vapor de agua y gases, requiere secado previo procesado (hidrólisis).

-Preparación de la materia prima, a la cual se le extraen las azucares monsacaridas fermentables.
-Fermentación en sí, que es común a todos los azúcares.
-Destilación, a partir de la cual se purifica al etanol del resto de los componentes de la mezcla. Esta está acompañada de varias impurezas que deben retirarse.

Sustancias con alto contenido de azúcar: pueden ser directamente fermentables (sorgo dulce, jugos de frutaS), o no directamente fermentables, o sea, poseen disacáridos q deben hidrolizarse p/poder usarlos (caña de azúcar, melazas o remolacha azucarera).
2. Con alto contenido de almidón: maíz, papa, yuca o mandioca, granos, raíces y tubérculos fermentables. El proceso es más complejo ya que el almidón debe hidrolizarse previamente antes de ser fermentables por sacarificación o conversión en azúcar, o sea, desdoblamiento de una polisacárido que libera los monosacáridos.
3. Sustancias con alto contenido de celulosa. La madera cuenta con un 50% de celulosa, 25% de lignina (se descarta) y 35% de hemicelulosa (pentosas y hexosas); se puede usar también residuos de fábrica de papel o agrícolas.

-Rizoplano: MOOs sobre la piel de la raíz.
-Endorizosfera: MOs dentro de la raíz.
-Ectorizosfera: MOs cerca de las raíces.
En la rizosfera hay mucha densidad de MOs y microfauna. Esta rizosfera le da estabilidad a las partículas gracias a la acción de sustancia secretadas por las plantas que estabilizan el suelo (exudados), estas sust también alimentan a los MOs con carbohidratos, vitaminas, factores de crecimiento, aa, ácidos orgánicos, mucigel (sust viscosa hecha de polisacáridos hidratado), etc. También hay se fija el 40% del C fijado en la fotosíntesis.

Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Son MOs muy eficientes en aumentar el crecimiento de las plantas e incrementan la tolerancia a otros MOs. Tienen una elevada densidad poblacional en la rizosfera después de su inoculación en las plantas, por lo que tienen una alta capacidad competitiva con la microflora nativa del suelo. Poseen una capacidad de colonización efectiva en la superficie de la raíz y, como consecuencia, pueden influir positivamente en el crecimiento de la planta. Pueden controlar de manera natural y eficiente a otros microorganismos del suelo capaces de enfermar a las plantas. Además, no producen daño en el hombre. La promoción del crecimiento que proporciona este tipo de bacterias puede ser directo o indirecto.

-Habilidad para generar nódulos en las plantas en las que esta va a ser cultivada
-La cepa debe ser capaz de fijar N en cant suficientes como para prescindir de fertilizantes nitrogenados
-Debe competir con otros MO del suelo.
-Debe ser tolerante a cond de stress por agentes fisicos o quimicos del suelo
-Debe ser estable a nivel industrial
-Debe sobrevivir en el suelo solo hasta que emerja la semilla germine.
-Debe resistir a insecticidas y fungicidas que se usan normalmente en el cultivo.
-Debe sobrevivir durante su distribución por parte del agricultor y su almacenamiento.
-Los MOs pueden ser cepas de colección (aisladas, conservadas y caracterizadas) o autóctonas del suelo (tienen más sobrevida pq están acostumbrados al clima y demás condiciones).

-Sumamente específicos para el insecto target.
-Producción de esporas.
-Resistentes a factores climáticos adversos.
-Pueden ser mantenidas en forma de polvo o emulsión.
-Fácilmente utilizables con equipamientos de aplicación de insecticidas químicos.
-Son inocuos para el hombre, otros mamíferos, flora y fauna.
-El número de cepas de Bt es muy amplio.

-Deben ser ingeridas por vía oral para ser efectivo.
-Cada cepa de Bt es específica para cada grupo de insectos.
-Su acción se restringe a un determinado estadio del desarrollo del insecto. La aplicación del producto debe ser más exacta y controlada.
-Resistencia ---> no se sabe si podrían generarse insectos resistentes al Bacillus.

Su actividad insecticida es específica según el tipo de proteína. Así tenemos:
- Cry I son tóxicos para lepidópteros (mariposas).
- Cry II son tóxicos para lepidópteros y dípteros,
- Cry III son tóxicos para coleópteros (escarabajos)
- Cry IV son tóxicos para dípteros (mosquitos).
- Forman un poro en la membrana del intestino, producen cese de la ingesta, parálisis del intestino, parálisis total y muerte.

había limitación en las provisiones de sangre, podría estar contaminadas con otros virus, y el método de producción era muy laborioso.

-Celulolíticos: fermentan carbohidratos estructurales, usan NH3 como fuente de N y crecen en el rango fisiológico desarrollándose mejor entre 6 y 6,9.
-Amilolíticos: fermentan carbohidratos no estructurales. Crecen más rápido. Usan HH3 , aminoácidos y péptidos como FN. Les es favorable el ambiente más ácido (5,5 a 6 de pH).

El uso de granos en cerdos produjo q se introduzca en su alimentación el ácido fítico, que no es asimilado. Para ello se agregó la enzima fitasa mejorando la digestión y disminuyendo la prod de fósforo de estos animales. También lo que se hizo fue obtener un cerdo transgénico insertando el gen de la proteína fitasa en su saliva, disminuyendo la cantidad de fósforo en su estiércol.

Los pollos de tipo parrillero (broiler) se han transformado en un alimento común y barato. Estos pollos han sido seleccionados a lo largo de 50 generaciones, y crecen 4 o 5 veces más rápido que sus antepasados. Sin embargo, han aparecido algunos efectos indeseados, como el aumento del tenor graso, la fertilidad baja y la presencia de anormalidades esqueléticas. Por otro lado, las gallinas seleccionadas como ponedoras desarrollaron osteoporosis, al desviar el calcio del esqueleto para la construcción de la cáscara de los huevos.

Limitante: el semen sexado es destinado a vacas novillonas q no han sido previamente gestantes. Esto debido al bajo porcentaje de preñez que el semen sexado ofrece, además de que, en vacas ya experimentadas, la suciedad del lugar de concepción no permitiría que el espermatozoide llegara a fecundar el óvulo con facilidad. Todo esto reduce la posibilidad de quedar gestante y producirá un costo mayor, ya q el semen sexado es relativamente caro.

La fiebre aftosa es una endemia que afecta la producción de carne y leche. Es una enfermedad viral, altamente contagiosa, que se manifiesta por fiebre alta y por el desarrollo de aftas en la boca. Es fundamental el desarrollo de nuevas vacunas, más eficientes y fáciles de aplicar, en las regiones donde la enfermedad no fue totalmente erradicada y suelen haber brotes. Las vacunas DIVA permiten distinguir animales infectados de animales vacunados. Se estudia también la sustitución de la vacuna actual del virus desactivado por alfalfa transgénica que exprese algunas proteínas del virus de la aftosa.

Son sustancias que potencian la respuesta inmune. Son preparados biológicos o químicos, que al ser incorporados con un AG hacen que la respuesta sea más efectiva, rápida y duradera porque reclutan, activan e inducen coestimuladores de la respuesta inmune. Sus mecanismos de acción son: Señales de estimulación aumentadas, aumenta la inflamación local, estimulación de linfocitos no específica (la actividad de las células estimuladas no va dirigida hacia ningún Ag en especial). El aulm (Aluminum hydroxide gel) es el que más se usa a escala industrial, así como también otros compuestos del aluminio (fosfato de aluminio). También hay otros tipos.

-Bacterias: degradan la pared celular de la celulosa y hemicelulosa. Usan Nitrógeno proteico y nh3. Hay alta densidad y esta se incrementa cuando hay muchos nutrientes.
-Protozoos: usan proteína del alimento y de bacterias. Cuando consumen bacterias amilolíticas engloban trozos de alimento y evitan la fermentación ruminal, proveyendo al animal de una fuente directa de glucosa. No usan nitrógeno proteico.
-Hongos: contribuyen con un 8% a la masa microbiana. Son en general levaduras transitorias. Poseen una importante actividad celulolítica.

-Inactivadas: Suspensiones de bacterias o virus muertos. Los microorganismos no se reproducen por lo que se necesitan varias dosis (generalmente de alta concentración) en diferentes períodos de tiempo, para inducir la inmunidad. Requieren mayor antígeno, estabilidad de almacenamiento, son más seguras y requieren un adyuvante crítico para lograr una buena inmunogenicidad.
-Atenuadas: Son preparaciones inmunógenas de virus o bacterias vivos, alterados de tal manera que no pueden provocar la enfermedad, pero sí una respuesta inmune importante. No son recomendables para gente inmunodeprimida. Requieren menor antígeno, menor estabilidad de almacenamiento, son menos seguras, no requieren un adyuvante no crítico.
-A toxoides: los toxoides son formas benigna de la toxina. La bacteria Clostridium tetani produce toxinas neurotóxicas. Se usan preparaciones obtenidas a partir de toxinas inactivadas de bacterias productoras. Por ej, vacunas de tétanos y difteria.

-ADN: están formadas por un fragmento de ADN unido a un promotor, inducen una respuesta inmune muy buena tanto a nivel humoral como celular.
-Subunidades: son a base de fracciones proteicas sintetizadas y purificadas a partir de MOs. El tipo de respuesta es similar a las clásicas inactivadas. Son seguras de producir y a bajo costo, pero requieren mayor cantidad de antígenos, la aplicación de varias dosis y adyuvantes.
-Recombinantes. Se pueden producir en bacterias, levaduras, sistemas de baculovirus o en células animales.

Es una vacuna de Nueva generación. Se produce el AG de superficie mediante la producción de la proteína HBsAG mediante tecnología recombinante. Este nuevo proceso garantiza la ausencia de contaminación de otras fuentes y permite la prod de grandes cantidades de vacunas. Esta se produce en diferentes huéspedes como levaduras y células CHO. Todas ellas son seguras, inmunogénicas y efectivas desde la primera dosis. Requieren adyuvantes.

Se producen las virus like particles en células de insecto Sf-9 utilizando a baculovirus como sistema de expresión. La proteína L1 es luego aislada por dos pasos cromatográficos usando intercambio iónico y cromatografía de hidroxiapatita cerámica. Se realizó una cromatografía de intercambio catiónico fuerte para lograr la purificación inicial de HPV33 L1 y eliminar la mayoría de las proteínas contaminantes, y la segunda hidroxiapatita cerámica. La cromatografía produjo partículas puras parecidas al virus HPV33 L1 (VLP).
-Sists de prod de la vacuna: Levaduras, plantas y e.coli con un folding posterior.

- Policlonales: preparaciones de ACs de animales inmunizados con AGs. Consisten en mezclas complejas de diferentes ACs producidos por muchos clones diferentes de células B.
- Monoclonales: preparaciones homogéneas de ACs producidas en el laboratorio. Consiste en un único tipo de sitio de unión al antígeno, producido por un único clon de células B.
- De nuevo: Los AG tienen epítopes que son regiones de la proteína que son reconocidas por los anticuerpos. Cada AG tiene varios epítopes, es decir, varias regiones que pueden ser reconocidas por ACs. Cada AC puede reconocer un único epitope. Cuando una solución de ACs tiene ACs que solo reconocen un único epitope, son soluciones de ACs son monoclonales (vienen de un único linfocito B). Son más específicos porque hay más probabilidades de que reconozcan el AG y no lo confundan con otro. Los AC policlonales son una mezcla de ACs que reconocen diferentes epítopes de un mismo AG. Estos son más potentes en la detección del AG.

Primero se inocula un animal con el AG del cual quiero provocar la rta inmune. El animal va a producir células B y cuando extraigamos el suero van a estar todos los AC del conejo que van a reconocer diferentes epítopes del mismo AG. Para monoclonales luego se aíslan los linfocitos B según su tipo ---> es monoclonal porque se aparta el linfocito B específico y van a liberar un único AC que reconoce un único epitope del AG. Si se aísla el LB y se lo fusiona a una célula de mieloma (hibridoma) y se cambian las cond de cultivo para que solo sobrevivan los hibridomas vamos a tener células que van a producir un único tipo de AC. Si hacemos diluciones de estas células, en cada pocillo va a haber una célula entonces vamos a haber separado cada AC por su lado. Luego se elige un hibridoma que sea el mejor productor de ACs.

Es con citostáticos, q frenan al tumor (no lo matan): antiangiogénicos, inhibidores de la traducción de señales celulares, AC monoclonales, vacunas, estimuladores del sistema inmune. El gráfico muestra tratamientos con AC monoclonales, de los cuales muchos ya se usan. Para usar un AC monoclonal primero hay que conocer detalles del tumor, por ej qué genes expresa, etc. Para recordar ---> procesos de angiogénesis: inducción de la vascularización de los tumores. Si un tumor está vascularizado puede proliferar rápidamente, en cambio si esto se bloquea el tumor deja de nutrirse y también deja de generar metástasis.

Que pueda ser destinado con la mayor especificidad celular posible a un órgano o tejido.
• Que proteja al ADN de posibles degradaciones enzimáticas durante su transporte.
• Que permita la expresión del gen con eficacia.
• Que no sea reconocido inmunitariamente ni provoque respuestas inflamatorias.
• Que sea seguro para el paciente y el entorno.

-Ex situ!!!
-Disposición del suelo contaminado en capas lineales y remoción periódica para favorecer la aireación, también se mejoran las condiciones para estimular la biodegradación (humedad, nutrientes, etc.).
- Hidrocarburos del petróleo (no VOCs), combustibles, PCP y algunos plaguicidas.
- Degrada, transforma e inmoviliza contaminantes.
- Recogida y tratamiento de escorrentías y lixiviados.

-Adyuvante: administrada para destruir células que pueden haber quedado en el cuerpo una vez extirpado el tumor por vía quirúrgica.
-Neoadyuvante: administrada antes del procedimiento quirúrgico para intentar reducir el tamaño del tumor. Se inicia antes de cualquier tratamiento quirúrgico o de radioterapia con la finalidad de evaluar la efectividad in vivo del tratamiento.
-Primera elección = primera línea = estándar: se ha determinado como la de mejores probabilidades para tratar un cáncer dado.
-Paliativa: aliviar manifestaciones de la enfermedad o prolongar el periodo libre de enfermedad.
-Segunda línea: se administra cuando la enfermedad no responde o reaparece después de la quimioterapia de primera elección. En algunos casos, se puede denominar de rescate.
-Radioquimioterapia: se administra de forma concurrente o a la vez con la radioterapia con el fin de potenciar el efecto local de la radiación y actuar de forma sistémica con la quimioterapia.

-Ex situ!!
-Mezcla de suelo contaminado con materiales porosos y enmiendas orgánicas (aserrín, ****, estiércol, restos vegetales) con el fin de promover la biodegradación (incremento de temperatura). Se usa para:
-Explosivos y PAHs.
- Mantener condiciones de oxidación (aireación), humedad (irrigación) y temperatura (54 – 65 ºC)
- Controlar la emisión de VOCs y SVOCs.
-Métodos de aireación: mezcla mecánica de montones (la más usada); estática, inyección o bombeo en pilas, agitación mecánica en contenedores.

-Partición, fisión o gemelación artificial: se usa en el estadío de mórula para obtener varios individuos (dif a sus progenitores) en semi embriones en úteros distintos. Genera un número pequeño de individuos clónicos .
-Paraclonación: transferencia de núcleos embrionarios o fetales. Se usan núcleos de embriones en estadio elastomérico, que se transfieren a ovocitos enucleados. El ovocito receptor aporta las mitocondrias. Los individuos son diferentes de los progenitores.
-Clonación verdadera: transferencia de núcleos de células somáticas de individuos nacidos a ovocitos enucleados. El ovocito receptor aporta las mitocondrias. Los individuos son casi idénticos a su progenitor.

→ Métodos virales: Virus Integrativos: Lentivirus y Retrovirus. Es más sencillo y barato pero no son recomendables para terapia celular porque no se sabe en qué parte del genoma se integran. Virus No-integrativos: Adenovirus, Sendai Virus
→ Métodos no virales: transfección de proteínas, transfección de mRNAs, transfección de microRNAs, vectores no-integrativos o excisables, compuestos químicos pequeños.

En la mórula, la masa celular sigue siendo totipotente. Cuando se pasa al blastocisto el grupo de células externas se llama trofoblasto y se ocupa de producir la placenta y las estructuras extraembrionarias. Dentro del trofoblasto está el macizo celular interno que da lugar al embrión. Las células madre embrionarias (pluripotentes) in vitro se obtienen a partir de esas células del MCI.

- Oct3/4: Implicado en el mantenimiento de la autorrenovación. Su represión en CME conduce a la formación del trofoectodermo.
- Klf4: reprime p53 directamente, la proteína p53 suprime Nanog durante la diferenciación de CME. Klf4 contribuye a la activación de Nanog y otros genes específicos de CME.
- Sox2: esencial para el desarrollo embrionario. La regulación por disminución mediante silenciamiento génico induce la diferenciación de CME murinas.
- c-Myc: el rol de c-Myc ha sido destacado como un posible regulador maestro de la pluripotencia.

- Totipotentes: pueden diferenciarse a células extraembrionarias y a cualquiera de las 3 capas germinales. La única q existe es el cigoto (ovocito fecundado). Generar completamente un nuevo individuo.
- Pluripotentes: pueden diferenciarse a cualquier tipo celular intraembrionario. Pueden ser embrionarias o inducidas; estas últimas se generan en el laboratorio a partir de células somáticas.
- Multipotentes: célula madre neonatal, pueden diferenciar a diferentes tipos de células.
- Unipotente: son las células madre adultas que solo pueden diferenciarse a un único tipo. Estas están en todos los órganos y tejidos, por ej las hematopoyéticas o las mesenquimales, que pueden diferenciarse a células sanguíneas o a condrocitos, respectivamente.

Con los años se fueron desarrollando métodos de cultivos in vitro de iPS humanas sin el cocultivo de MEF. Este tipo de cultivo se usó por 1ra vez en 2001, y se reemplazó a las MEF por una matriz comercial q usa medio de cultivo previamente condicionado por MEF. Luego se desarrollaron medios de cultivo completamente definidos. Con los años empezaron a desarrollarse medios definidos optimizados que permiten independizarse de la capa nutricia para investigar con CMPh. Estos medios son muy caros pero permiten cultivar óptimamente las células pluripotentes sin MEF.

- Primario: las aguas pasan por filtración y decantación que remueve objetos grandes, basura y arena. En el tanque de sedimentación, la grasa sobrenadante se separa del lodo sedimentado, que puede ser transferido a un biodigestor
- Secundario: el líquido efluente se pasa a lagunas poco profundas donde hay movimiento para oxigenar el agua y los propios MOs de la cloaca digieren la materia orgánica. También pueden tratarse los lodos activados inyectando aire para oxigenarlo.
- Terciario: se eliminan sust org e inorg mediante filtración, volatilización, etc
- Cuaternario: se eliminan MOs patógenos (cloración, irradiación UC, tratamiento con ozono).

- In situ!!
-Consiste en la inyección o extracción de aire para estimular la degradación aerobia o anaerobia. Puede llevar entre meses y años. Se aplica para decontaminar
- Sirve para hidrocarburos del petróleo, disolventes no clorados, algunos plaguicidas y otros orgánicos (fuels).
- Favorece la degradación de VOCs (compuestos orgánicos volátiles) por la lenta migración hacia zonas biológicamente activas del suelo.
- Prometedora para estabilizar o eliminar contaminantes inorgánicos (cambio de estado de valencia, cambio en movilidad).

-In situ!!!!
-Estimulación de la actividad de microorganismos del suelo (o inoculados) mediante la circulación de soluciones acuosas ricas en nutrientes para que proliferen o productos enmendantes y sautradas en oxígeno disuelto. Se usa en:
- PAHs, non-halog. SVOCs y BTEX (contaminantes no extraíbles por volatilidad).
- Degrada contaminantes orgánicos e inmoviliza los inorgánicos.
- Efectiva en contaminaciones residuales (bajas concentraciones) y tras medidas de extracción, limpieza o remoción.

-IN situ!!!
-Introducción en el suelo de MOs seleccionados, adaptados o genéticamente modificados para degradar contaminantes específicos. Es una técnica de largo plazo y sirve para contaminantes org o inmovilizar los inorg. Se usan hongos y bacterias. Se usa para:
-PCP, Lindano, DDT, 2,2-diclorofenol.
- Degrada contaminantes orgánicos e inmoviliza los inorgánicos.
- Descontaminación de campos de batalla (US Dep. Defense).

-Ex situ!!!
-Se extrae el suelo contaminado, se lo lleva a otro lugar para mezclarlo con suelo no contaminado, los montones de tierra se confinan y se les inyecta aire (o se les extrae si se quiere que sea anaerobio) y se recogen los gases y lixivian para tratarlos. Puede llevar de semanas a años.
- Efectiva para VOCs no halogenados y combustibles; efectividad variable para algunos VOCs halogenados, SVOCs y plaguicidas.
- Incrementa la degradación favoreciendo las conds de humedad, temp., nutrientes, oxígeno y pH.
- Impermeabilización completa de la pila (acompañar con técnicas de recogida y tratamiento de gases y lixiviados).

Falso. Por eso cuentan con la gota o gotera.

-Ex situ!!!!
-Mezcla de suelos contaminados con lodos, agua y aditivos, para favorecer la biodegradación al incrementar el contacto entre los MOs y el contaminante, dentro de un “bioreactor”.
- Explosivos, PAHs, plaguicidas (primer tratamiento de SVOCs y VOCs al excavar un suelo).
- Biorreactores secuenciales aeróbicos/anaeróbicos, mejoran la remediación de PCB, algunos SVOCs halogenados y explosivos.
- 1º Tamizar suelo; 2º Mezclar suelo con agua, arena y lodo; 3º Añadir oxígeno y nutrientes (a veces tb. microorgs.) 4º Filtrado y secado del suelo y tratamiento de resíduos.

a., b. y d.

- Tipo de interacción : biocatalítica o bioafinidad
- Elemento de reconocimiento: enzima, tejido, AC, ácidos nucleicos.
- Definición de la interacción: directa o indirecta
- Sistema de transducción: electroquímico, óptico, termométrico, nano mecánico.

Tiene un biorreceptor que reconoce al analito a detectar. Este biorreceptor tiene un comp biológico (una enzima, un AC, un MO, ADN/ARN, etc.) que reconoce al analito y genera una señal (luz, aumento de T, cambio de pH, etc) q es transducida para generar una señal que es detectada por un detector.

- Alta sensibilidad, que puedan dar señal ante bajas conc de analito
- Alta selectividad: que no hayan inferencias que puedan dar una señal
- Tiempo de vida: que sea largo
- Tiempo de análisis: que el tiempo para el 95% de la respuesta tarde poco
- Que tenga bajo costo

-Grupo 1. Bajo riesgo individual y colectivo. Microorganismos que nunca fueron descritos como agentes causales de enfermedades para el hombre y que no constituyen ningún riesgo para el medioambiente. Ejemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algunas cepas).
-Grupo 2. Riesgo individual moderado, riesgo colectivo limitado. Microorganismos que pueden causar enfermedades en el hombre, con poca probabilidad de alto riesgo para los profesionales del laboratorio. Ejemplos: Salmonella, Toxoplasma, virus del sarampión, virus de la hepatitis B.
-Grupo 3. Riesgo individual elevado, riesgo colectivo bajo. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves a los profesionales del laboratorio. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y VIH.
-Grupo 4. Serio riesgo para los profesionales del laboratorio y para la comunidad. Microorganismos que causan enfermedades graves para el hombre. Ejemplos: virus Ébola, virus Marburg.

- Vectores retrovirales: se pueden introducir secuencias menores a 8kb, se insertan sólo en células en división, el mutágeno se inserta con un gen residente desconocido, hay riesgo de producir virus de tipo silvestre por recombinación.
- Vectores adenovirales: permiten secuencias de hasta 35kb, se insertan tanto en células en división como en reposo, índice de expresión del gen terapéutico elevado, no se inserta en cromosomas.
- ADN-liposomas: no estimulan reacciones inmunitarias, se insertan tanto en células en división como en reposo, tienen baja eficiencia.

La idea es poder evaluar cuáles serían los efectos adversos de persona a persona. Es muy común q se administren ciertos tipos de droga q podrían tener efecto de persona a persona, por lo cual poder analizar masivamente el background genético de c/paciente dado q hay polimorfismo en la población, por lo cual los cambios ligeros en los alelos podrían causar q una droga no funcione o sea menos precisa mientras q en otras personas funciona bien. Si se evalúa a c/paciente antes de suministrar la droga podrían evitarse los efectos adversos innecesarios o evaluarse qué droga es mejor para cada persona.

ITR: secuencia de reconocimiento viral
-HCRhAATp: promotor de la Cas9.
-SaCas9: gen de la Cas9.
-PolyA: secuencia de poliadenilación.
-U6p: promotor U6.
-gRNA: secuencia del gRNA.

-Diseñar la guía y cortarla con enzimas.
-Cortar el plásmido con las mismas enzimas de restricción.
-Ligar todo junto.
-Transfectar la construcción ligada en el plásmido a las células.
-Seleccionar las que hayan recibido el plásmido y cultivarlas.

-Promotor U6: es constitutivo, controla la expresión del gRNA.
-gRNA Scaffold: andamiaje para el gRNA. Codifica para el RNAtracker o transactivador.
-EF1a: promotor eucariota que controla a IGFP.
-IGFP: gen de screening para la proteína verde fluorescente
-Promotor CMV: es un promotor eucariota constitutivo fuerte que controla a Cas9
-CAS9: gen de la Cas9.
-Ori: origen de replicación.
-AMP: gen de resistencia a ampicilina

Debemos asegurarnos de que solo hay un target y el gRNA no se va a unir a otras regiones. Para eliminar los off-target se pueden usar el cas-9 modificado, es decir, usar dos gRNA, uno para cada hebra, con dos Cas9 que corten solo una hebra. La idea es que ambas CRISPR corten en la misma zona. Esto hace que se bajen los posibles offtargets.

Es una manera de agrupar genes o proteínas según su función, mecanismos biológicos en los que participan, y a datos moleculares.

Porque son análisis cualitativos, no cuantitativos. Los aumentos o disminuciones se fijan con una línea de corte. si cada persona elige el cutoff o decide cuándo aumenta y cuando no a partir de un valor arbitrario, tenemos que validar con una cuantificación por ej densitometría o elisa.

PCR nested se basa en una primera ronda de PCR con un par de primers externos, y una segunda ronda con un juego de primers internos.

Ventaja: mayor especificidad. Desventaja: más laborioso. Riesgo de falsos negativos, ya que se determina el sexo femenino por AUSENCIA de señal.

-Los siRNA nacen como RNAs doble cadena, pero se diferencian con el pre-miRNA porque su precursor no forma hairpin, sino que es una molécula doble cadena larga, por los cual no participa DROSHA.
-Interactuan solo con AgoII.
- La complementariedad del siRNA con el mRNA target es del 100%, lo cual deriva en el clivaje del mismo

-Los primers de expresión deben pegar en exones diferentes y preferiblemente deberían pegar en la secuencia codificante.
-Para clonar, el espacio entre los primers debe incluir la secuencia cds completa. Además, debería tener un sitio de corte para enzimas de restricción y 4 a 6 nt extra para que no se patine.

- % GC: debe ser de e/ 40 y 60.
-Tm de cada primer del par: deberían ser iguales e/sí. Generalmente se encuentra alrededor de los 60°.
-autocomplementariedad: capacidad de un primer de unirse a sí mismo. Debe evitarse.
-formación de dímeros de primers: sucede cuando los primers se pegan entre sí (el par). La idea es que no lo hagan.

El siRNA tiene que tener hasta 21nt para poder funcionar. La argonauta del DICER reconoce dcRNAs de aprox 21nt de largo. Tiene que ser complementario al molde

Un buen control consiste en ingresar algo a la célula que no genere cambios. Puede ser un plásmido vacío, o un siRNA, gRNA, etc (según el mecanismo que se use) que sean aleatorios y no tengan offtargets. Esta ultima opción es mejor porque podemos ver si los efectos se deben al tratamiento o al ingreso de algo extraño a la célula.

Normalmente suelen usarse réplicas biológicas/experimentales, que consiste en repetir el experimento de cada tubo de cada tratamiento 3 veces, en 3 muestras independientes. También pueden usarse réplicas técnicas: a cada tubo no se le hace una sola PCR, sino 2 o 3 veces, partiendo de la misma muestra. Las réplicas biológicas dan fiabilidad al experimento y no pueden descartarse sus resultados, mientras que las réplicas técnicas permiten ver si hay algún error en la técnica en sí (por ejemplo, mal funcionamiento del aparato). Es conveniente usar ambas: las réplicas biológicas para validar que nuestro experimento es reproducible y fiable, y las técnicas para constatar que no hubo errores técnicos.

Ss un oligonucleotido sintetizado artificialmente que imitan al miRNA, es decir, cumple la misma función que, suponemos, tiene ese miRNA dentro de la célula. Al momento de realizar la experimentación no se sabe si el miRNA que estamos investigando se expresa en la célula ni en qué cantidad, entonces la adición del mimic tiene como propósito emular su posible función y/o inducir el miRNA en ella. En caso de que hubiese alguna cantidad de miRNA preexistente, su efecto se va a potenciar.

Primero, averiguar la secuencia complementaria de el sitio donde va a hibridar el primer e invertir el sentido de lectura (pasar a 5'--> 3'); luego agregarle en el extremo 5´ la otra secuencia de corte de ER, y agregarle 4 nucleótidos extra.

Es el polímero natural más abundante en la naturaleza. Forma parte del tejido de sostén de todas las plantas. Tiene estructura lineal; se forma por la unión de molécula de B-glucosa mediante enlaces B-1,4O-glucosídico. En la estructura lineal se establecen múltiples pdH entre los grupos H de las cadenas de glucosa y originan las fibras compactas que constituyen la pared celular.

Son una familia de poliésteres de reserva producidos por bacterias Gram -. Se obtienen a partir de la fermentación microbiana y de azúcares. La variabilidad de sus grupos funcionales, así como de monómeros, grados de polimerización, etc, permiten que se sinteticen en varias formas químicas con propiedades diversas. El PHB es el de cadena más corta. Existen más de 150 tipos de PHAs. Son insolubles en H2O, biodegradables y no tóxicos.

Es un polímero obtenido a partir de almidón de maíz. A partir de la fermentación se obtiene el ác láctico y después se somete a una polimerización sintética = PLA. Tiene do enantiómeros (D y L) y la relación entre el contenido de ambos determina sus propiedades (L=cristalino o D.L=amorfo)

Los mayores productores de bioetanol son EEUU y Brasil. El uso de maíz para producir etanol en EEUU creció desde el 10% en 2002/03 hasta el 24% previsto para 2007/08. Brasil, es cambio, lo produce a partir de caña de azúcar.

El mayor productor de biodiesel es la UE y el aceite de colza la principal materia prima. Un mandato europeo obliga a que, en 2020, el uso de biodiesel sea del 10%, pero la UE no puede producir suficiente colza por lo que deberá importar colza o biodiesel. Rusia y Ucrania están incrementando su producción de colza para exportar a la UE la semilla, el aceite, o directamente biodiesel.
Brasil y Argentina utilizan aceite de soja para su producción de biodiesel, el primero para consumo interno y el segundo para exportación.

El mosto es el sustrato azucarado que se obtiene luego de pre-tratar la materia prima, no importa si la materia prima es rica en azúcares, almidón o celulosa. Las operaciones que se llevan a cabo para obtenerlo desde diferentes materias primas varían. A partir del mosto se puede fermentar y destilar para obtener bioetanol y vinazas. La vinaza es el subproducto líquido de la destilación del mosto.

-Los Frankia son un género de actinomicetos que fijan nitrógeno en simbiosis con las plantas actinorrizas en suelos pobres en nitrógeno o en condiciones de estrés ambiental.
-Cianobacterias/arroz. Las cianobacterias (Anabaena sp.) han desarrollado estrategias especiales dirigidas a la convivencia de la fijación de N (proceso anaerobio) con la fotosíntesis.
-Asociación Rhizobium-leguminosa: el caso de la soja.
-Azospirillum- caña de azúcar. No se forman estructuras especializadas en las raíces. Se da la asociación entre plantas de maíz o caña de azúcar con las bacterias Gluconacetobacter, Azoarcus, Herbaspirillum o Azospirillum.